4.2. Műveletek a DNS-sel

Ebben a fejezetben áttekintjük, milyen műveleteket végezhetünk a DNS láncokkal, milyen utasításokból lehet a „DNS gép programját” felépíteni.

A kísérletek során az úgynevezett (molekuláris) levessel dolgoznak a kutatók, ami általában olyan vizes oldat, ami a DNS molekulákon kívül tartalmazhat különböző enzimeket, katalizátorokat. Formális szempontból az ilyen molekuláris levest egyszálú és kétszálú DNS molekulák halmazának tekintjük, feltételezve, hogy mindenféle molekulából elegendően sok van a levesben. Ez a gyakorlatban elterjedt eljárások során valójában nem jelent megszorítást, ahogy látni fogjuk.

4.2.1. Denaturálás

A DNS molekula komplementer párjai közötti hidrogén-kötés jóval gyengébb, mint az egyszeres láncokon belüli foszfodiészter-kötés (kovalens kötés). Az egyes bázispárokat, és így a kettős spirál két láncát is, könnyebben el lehet választani egymástól. Erre az egyik megoldás a molekula melegítése - denaturáció -, amelynek hatására a molekula két összekapcsolódott lánca különválik egyszeres DNS láncokat eredményezve.

4.2.2. Renaturálás vagy hibridizáció

Az egyszeres láncok a hűtés hatására újra összekapcsolódhatnak (rekombinálódnak), vagy más egyszálú DNS-sel új kétszálút hozhatnak létre. (Természetesen a Watson-Crick komplementaritás figyelembe vételével.)

Tehát az egyszeres láncok duplaszálú DNS-sé állhatnak össze. Mint később látni fogjuk ebben a lépésben fontos szerepet játszhat a ligáz enzim.

Az előző két művelet tulajdonképpen implicit részművelet, valójában összetettebb műveletekben fogjuk őket általában használni.

4.2.3. Szintetizálás

Ha még nincs DNS láncunk, akkor gyakorlati módszerek vannak arra, hogyan állíthatunk elő. Egyszálú DNS láncot szintetizálhatunk, vagyis mesterségesen előállíthatunk (felépíthetünk), bármilyen bázissorrendben néhány 100 nukleotidot tartalmazó méretig. Ezt a műveletet hívjuk szintetizálásnak.

4.2.4. Sokszorozás

Fontos probléma, hogy hogyan erősíthetjük meg a kis mennyiségű, számunkra fontos DNS molekula jelenlétét a hatalmas mennyiségű, számunkra nem fontos darab között. Az erre szolgáló technikát polimeráz láncreakció nak nevezzük. Segítségével milliószámra lehet előállítani a kívánatos molekulákat egyetlen molekulából.

Ez egy összetett művelet, ami arra szolgál, hogy a kívánt kétszálú DNS-láncokból elég sok legyen jelen a levesben (pl. a leves több részre történő szétöntéséhez).

Ennek egyik lépése a denaturálás, melynek során megfelelő egyszálú DNS láncok jönnek létre a sokszorozni kívánt kétszálú molekulából. Az oldatba ugyancsak teszünk úgynevezett primereket, amik a láncok végein található viszonylag rövid részek (végek) komplementerei. A renaturálás során ezek a rövid primerek sokkal valószínűbben tapadnak össze az egyszálú DNS láncaink végeivel, mint hogy azok újra egymásra találjanak. Ezután az oldatban levő nukleotidokból az egyszeres láncok kétszálúakká egészítődnek ki a polimeráz enzim segítségével: Az enzim létező a félig kétszálú DNS molekulához további nukleotidokat képes hozzákapcsolni a következő módon: tegyük fel, hogy a DNS-szál eleje kétszálú, és egy adott ponttól kezdve csak a - irányú szál van meg ( 4.7. ábra).

4.7. ábra - A polimeráz enzim kiegészíti a DNS láncot.

A polimeráz enzim kiegészíti a DNS láncot.

Ekkor, ha az oldatban jelen vannak a nukleotidok, a polimeráz enzim felismerve, hogy milyen bázisú nukleotidnak kell következnie a még hiányzó - irányú láncon, beilleszti a következő nukleotidot. Ezáltal lépésenként haladva létrehozza a teljes kétszálú DNS-t úgy, hogy a hiányzó molekulákat sorban hozzáfűzi a meglévő lánchoz. Az enzim csak szénatomhoz kapcsolódó új nukleotidot (azt annak az szénatomjával kapcsolva) képes a kiterjesztést véghez vinni. Ezért is kellett olyan primereket használnunk amik ehhez az irányhoz viszonyítva a lánc elejét jelentik.

Így sokszorosíthatjuk a láncokat, ha van egy kétszálú DNS-ünk, akkor ezt szétválasztjuk a bázispárok mentén, ezután a polimeráz enzim segítségével elő tudunk állítani a kiinduló lánccal megegyező két láncot. Az eljárás során rövid idő alatt exponenciális gyorsasággal emelhető meg adott molekulák száma a levesben, akár milliószorosára is emelhető egyes láncok száma.

DNS molekulák kiválasztására kétféle módszert szoktak használni, az első adott minta alapján választja ki a megfelelő molekulákat, a második pedig hossz alapján.

4.2.5. Pecázás

Legyenek egyszálú DNS láncaink a molekuláris levesben.

A célunk az oldatot 2 részre osztani oly módon, hogy az egyikbe olyan molekulák kerüljenek, melyek adott rövid bázissorozatot tartalmaznak.

Ekkor a levesbe egyszálú DNS-láncokat (a kívánt láncrész komplementerláncát) lógatunk, amikhez azok a láncok tudnak a levesből hozzátapadni (H-kötéssel) amelyek tartalmazzák a belógatott lánc komplementer sorozatát, vagyis tartalmazzák a kívánt bázissorrendű részt. Így kipecázhatjuk a megfelelő molekulákat.

4.2.6. Hosszmérés

Egy DNS hosszán a benne található bázisok, vagy bázispárok darabszámát értjük. Most a célunk az, hogy az oldatból kiválasszuk az adott hosszúságú DNS láncokat.

A mérés alapját a gél elektroforézis nevű eljárás képezi. Töltéssel rendelkező részecskék elektromos térben töltésükkel ellentétes irányban gyorsulnak. A DNS molekulák vizes oldatban negatív töltésűek, a pozitív töltésű anód felé mozognak gyorsulva az elektromos térben. A molekula töltése és így a rá ható gyorsító erő arányos a hosszával, csakúgy, mint a tömege. Viszont így, a hossztól függetlenül, minden DNS molekula ugyanúgy mozogna az elektromos térben. Az ötlet az, hogy olyan speciális anyagban, gélben kelljen a molekuláknak haladniuk, ami a hosszabb molekuláknak komolyabb ellenállást jelent. Így különböző méretű molekulák különböző sebességre állnak be, így adott távolság megtételéhez szükséges időből ki lehet számítani a molekula méretét. A 4.8. ábra mutatja sematikusan a hosszmérést.

4.8. ábra - DNS láncok szétválasztása hossz alapján gélelektroforézissel.

DNS láncok szétválasztása hossz alapján gélelektroforézissel.

4.2.7. Bázissorend meghatározása - a szekvenálás

Tulajdonképpen a gél elektroforézis egyfajta továbbfejlesztéséről van szó. A DNS láncokat az ún. Sanger módszerrel olvashatjuk el.

Az eljárás során analóg nukleotidokat gyártunk le oly módon, hogy a szénatom OH csoportját H-re cseréljük. Az így létrehozott didezoxi-adenin ( ddA ), didezoxi-citozin ( ddC ), didezoxi-guanin ( ddG ) és didezoxi-timin ( ddT ) molekulák szerkezete olyan, hogy bennük a szénatomhoz nem tud másik molekula foszfodiészter-kötéssel kapcsolódni. Ennek megfelelően módosítjuk az előző sokszorozó algoritmust is. Négy lombikban fogjuk a sokszorosítást végezni, ezek mindegyikébe valamelyik analóg molekulából is teszünk. Ez alapján fogjuk megkülönböztetni a lombikokat. Egy lombikban keletkezhet teljes duplaszálú DNS, de olyan is amit a polimeráz enzim nem tud folytatni, mert az eredeti nukleotid helyett annak analóg párját, didezoxi nukleotidot tartalmaz. Ekkor a sokszorozás után, ha újra denaturáljuk a molekulákat lesznek olyan egyláncú DNS-ek amik nem a teljes hosszúságúak, hanem valahol didezoxi-nukleotiddal fejeződnek be. Ezután a molekulák hosszának mérésével megállapítható, hogy az egyes lombikokban milyen hosszúságban játszódhatott le a kiterjesztés folyamata. Világos, hogy ezek a hosszak pontosan a lehetséges didezoxi molekulák helyeit jelentik az adott lombikból. Viszont a didezoxi molekula csak az ő analóg párjának megfelelő helyen lehet a molekulában, tehát az eredeti molekulában ezen a helyen az a nukleotid szerepelt, aminek analógját az adott lombik tartalmazza.

Így a négy analóg nukleotidokat (is) tartalmazó lombikra elvégezve a gél elektroforézist megkapjuk az eredeti molekula nukleotidsorrendjét.

4.2.8. Enzimek

Egyes alapműveletek végrehajtásában a természet által adott enzimeket használjuk.

A már részletezett polimerázon kívül ilyenek pl. a következők:

A ligáz enzim alapvető szerepet játszik az élő sejtekben is. A kettős DNS-láncokon végighaladva ellenőrzi a foszfodiészter-kötéseket, ha valahol hiányzik a kötés, akkor helyreállítja (a molekula nem esik szét a két láncot összetartó hidrogén-kötések, illetve a másik láncon meglevő foszfodiészter-kötés miatt).

A számítások során is fontos szerepet játszik ez az enzim, amikor rövidebb láncokból építünk fel hosszabbakat. (Rövid láncok összekötése, a későbbiekben mutatunk erre példát.)

Egyes számításokban fontos szerepet játszanak az ún. vágóenzimek (restrikciós endonukleázok). Ezekből nagyon sok ismert. Általános működési elvük a következő: Dupla láncot vágnak ketté és csak meghatározott helyen. Az enzim megköti a molekulát egy specifikus felismerő helyen, ezen belül vagy kívül kettéhasítja azt. Ha egy DNS molekula több ilyen felismerő helyet tartalmaz, az enzim bármelyik ilyen helyen elvágja azt. Ez a vágás lehet lépcsőzetes is, két „ragadós véget” hagyva meg, pl. 4.9. ábra. Az ilyen ragadós végű DNS molekulák, ha a ragadós végeik egymás komplementerei könnyen összeragadhatnak új molekulát képezve.

4.9. ábra - Egy vágás „ragadós végek” létrehozásával.

Egy vágás „ragadós végek” létrehozásával.